技術情報・その他動物毛のDNA検査プロトコル

動物毛のDNA検査プロトコル

動物毛（異物）判定における注意点

　DNA検査を行うにあたっては、試料異物の混入していた原材料の状況を熟慮してください。
　また、可能な限り顕微鏡観察を行い、最終判定は出来る限り慎重に行ってください。

動物毛のDNA検査プロトコル

次の4つのステップがあります。

動物毛の洗浄・採取 0.5時間
DNAの抽出 1.5時間
PCR 　　 1.5時間
アガロースゲル電気泳動　　　　 1.0時間

1　動物毛の洗浄・採取

　70%エタノールで付着物を除き、カミソリでカットしてマイクロチューブに採取します。

2　DNAの抽出

　DNA抽出試薬 QIAamp DNA Micro Kit(50)を用いて約15マイクロリットルのDNA溶液を調製します。（詳細は下記マニュアル参照↓）

　https://www.qiagen.com/jp/resources/resourcedetail?id=db457676-7cd4-4f24-8f06-fbcccf0b4797&lang=ja-JP

3　PCR

　PCR用酵素　QIAGEN Fast Cycling PCR Kit(100)と動物DNA検出プライマーを用いてPCRを行います。

　（PCR酵素：https://www.qiagen.com/jp/resources/resourcedetail?id=0c546b1f-04ad-4f3d-83fe-d46a09d74e7f&lang=ja-JP）

〈反応組成：1動物ごとの検出の場合〉
PCR Master Mix                      10　μl
10×Coralload Dye                    2　μl
動物プライマー(10μM each)       1　μl
調製したDNA溶液                      2　μl（適宜変更可）
RNase free H2O                       5　μl（適宜変更可）
Total                                     20　μl
※陽性対照は動物DNA、陰性対照は添付滅菌水を使用

〈反応条件〉
95℃, 5min →【96℃, 5sec　→　60℃, 5sec　→　68℃, 9sec】　→　72℃, 1min
　　【　　】45サイクル（～50まで適宜）

　動物の種類が推定できない場合は、

　プライマーセットA（牛プライマー1μl＋豚プライマー1μl＋鶏プライマー1μl＝3μl）
　プライマーセットB（馬プライマー1μl＋羊プライマー1μl＋山羊プライマー1μl＝3μl）
　プライマーセットC（兎プライマー1.25μl＋犬プライマー1.25μl＋猫プライマー0.5μl＝3μl）
　プライマーセットD（ドブネズミプライマー1μl＋クマネズミプライマー1μl＋ハツカネズミプライマー1μl＝3μl）

　　　で4反応を行い、バンドが検出された動物についてシングルPCRで確認試験を行います。